Александра Петрухина erid:2VfnxxySFXw Сателлит открыл Илья Гагарин (лаборатория молекулярной диагностики ГБУЗ «МГОБ №62 ДЗМ») с рассказом о применении цифровой капельной ПЦР в клинической практике. В настоящее время все молекулярные методы тестирования в онкодиагностике можно разделить на два больших блока: методы, основанные на полимеразной цепной реакции ПЦР, и методы, основанные на секвенировании. Методы, основанные на ПЦР, в свою очередь, делятся на три группы: классическая ПЦР, которая сейчас практически не используется в диагностике, а чаще применяется как предварительный метод для секвенирования, ПЦР в реальном времени и цифровая ПЦР. Докладчик рассказал подробнее о принципе метода цифровой ПЦР. Если взять обычную реакционную смесь для ПЦР в реальном времени и сделать из нее водно-масляную эмульсию на десять и более тысяч капель, получаются множественные повторы одного и того же образца; каждая ячейка становится отдельным микрореактором. Почему эта ПЦР «цифровая»? Если посмотреть флуоресценцию в каждой капле, то ячейки с положительным сигналом, то есть с наличием флуоресценции, будут обозначаться единицей, а ячейки без флуоресценции, которые по распределению Пуассона оказались без ДНК-мишени, — нулем. Таким образом, отношение положительных сигналов к общему количеству ячеек позволяет определить концентрацию мишеней в образце. Где можно применять цифровую ПЦР? В первую очередь, интересно применение в онкологии — обнаружение редких мутаций или вторичных мутаций, которые возникают в ходе терапии. Метод позволяет выявлять низкие концентрации мутантного аллея, которые не могут быть детектированы обычным real-time ПЦР. Другие области применения цифровой ПЦР в онкологии — это анализ библиотек и подтверждение результатов NGS. Высокая точность метода цифровой ПЦР позволяет подтверждать найденные при секвенировании варианты. Хотя NGS — очень популярный и востребованный метод, его чувствительность пока недостаточна для того, чтобы конкурировать с цифровой ПЦР, подчеркнул докладчик. Первой в производстве приборов для цифровой капельной ПЦР была компания BioRad. Изначально это была система из трех приборов: один предназначен для генерации капель, второй — для амплификации методом Real-Time PCR, третий — для чтения капель, фактически клеточный сортер. Прибор Digital PCR SkyGen D30 представляет собой систему «всё в одном». Три аппарата объединены в одном корпусе: модуль генератора капель, 12 независимых модулей амплификации (каждый на 8 ячеек, таким образом, можно обрабатывать до 96 образцов одновременно) и модуль чтения флуоресценции, имеющий пять каналов детекции. Генератор капель позволяет создавать от 50 до 150 тысяч капель на лунку. В практике Ильи Гагарина получалось 112 тысяч капель, что сильно превышает количество капель в приборах компании BioRad (в среднем 8–10 тысяч капель). Анализ данных может происходить как в реальном времени — прямо в процессе исследования на приборе, так и по завершении работы прибора, на компьютере. Программа дает возможность видеть, какой чип в данный момент находится на каком этапе, посмотреть конечные данные. Помимо этого, софт просчитывает статистические данные по каждому образцу, а сведение в таблицу позволяет оценить качество прохождения того или иного исследования. С помощью Digital PCR SkyGen D30 Илья Гагарин с коллегами анализировали мутации генов EGFR в плазме крови. Этот анализ имеет большую клиническую значимость, так как только по плазме крови можно адекватно оценить прогрессию немелкоклеточного рака легкого. Набор для ПЦР позволял выявлять не менее 52 мутаций EGFR, в том числе все стандартные мутации, включая первичные, а также несколько вторичных и третичных. Он подходил для работы как с плазмой, так и с тканью. Чувствительность обнаружения для плазмы крови составила около 0,1% — таким образом, цифровая капельная ПЦР на порядок чувствительнее, чем самые лучшие наборы на основе real-time ПЦР. Весь анализ проходит в автоматическом режиме, софт автоматически определяет, какая мутация обнаружена в данном образце, и подсвечивает его своим цветом. Илья Гагарин подчеркнул, что результаты автоматического анализа следует перепроверять, так как могут быть артефакты. Некоторые из них связаны с деградацией образцов из-за того, что образцы циркулирующей опухолевой ДНК плохо хранятся при обычном замораживании: лучший вариант их хранения — при -80°С. Прибор D30 позволяет запускать несколько разных программ благодаря независимости от модуля амплификации. Возможность дозагрузки стандартного 96-луночного прибора фактически превращает его в «бесконечную» потоковую систему. При этом дополнительная загрузка может быть уже начата через час после запуска протокола. Следующей выступила Татьяна Лисица (НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, ЦСП ФМБА России). В центре им. Н.Н. Блохина Татьяна с коллегами не занимается профилактикой, к ним попадают пациенты с уже диагностированным злокачественным образованием. Колоректальный рак (КРР) — одна из социально значимых проблем; среди онкозаболеваний он входит в пятерку самых распространенных болезней и в тройку ведущих причин смертности. Эта болезнь в большинстве случаев развивается долго, есть предшествующие стадии. Описаны три пути прогрессирования КРР — аденоматозный, зубчатый и воспалительный. Скрининг любыми методами достоверно снижает заболеваемость КРР и смертность от этой патологии, подчеркнула докладчица. Существует множество принципиально разных методов скрининга на КРР. Гваяковый тест на скрытую кровь. Это самый дешевый тест, который имеет небольшую чувствительность и небольшую специфичность. Специальные тест-полоски можно использовать самостоятельно дома. Метод требует предварительного соблюдения диеты, потому что реакция происходит с любым гемоглобином, даже тем, который содержится в пищевых продуктах. Также при желудочно-кишечных кровотечениях из верхних отделов тест дает ложноположительный результат. Фекальный иммунохимический тест. Он более чувствителен и специфичен, не реагирует на гемоглобин, который мы получаем с пищей или на желудочное кровотечение. Сигмоскопия — эндоскопический осмотр дистального отдела ободочной кишки, не такой инвазивный и травматичный, как колоноскопия. Позволяет удалить полипы, взять биопсию, но не оценивает проксимальный отдел кишечника (прямую и сигмовидную кишку). Колоноскопия — золотой стандарт, но это инвазивная и малоприятная процедура, некоторые пациенты могут ее проходить только под седацией. Требует длительной подготовки и при недостаточно тщательной подготовке, не обеспечивающей визуализацию, дает ложноотрицательные результаты. Остаются риски кровотечений и перфораций. КТ-колонография. Быстрый метод, но тоже требует подготовки. Из минусов — лучевая нагрузка и то, что в случае находки все равно потребуется эндоскопия. Капсульная колоноскопия. Комфортна для пациента, но метод не прижился из-за высокой цены и недостаточной пользы. Тесты на метилированную ДНК в кале и плазме крови. По метилированию промоторов в зонах фекальной ДНК, богатых CpG-островками, можно «рассмотреть» различные изменения слизистой, а в циркулирующей ДНК — более системный процесс. Метилирование — хороший биомаркер, поскольку именно этот генетический механизм обуславливает изменение экспрессии генов. Татьяна Лисица с коллегами использовали набор iColocomf для оценки экспрессии генов SDC2 и TFPI2 в ДНК из образцов стула. Ген SDC2 кодирует трансмембранный гепарансульфат-протеогликан (синдекан-2), принадлежащий к семейству синдеканов. Он функционирует как интегральный мембранный белок и участвует в пролиферации, миграции и взаимодействии клеток с матриксом. Изменение экспрессии синдекана 2 обнаружено в некоторых типах опухолей. Ген TFPI2 (Tissue Factor Pathway Inhibitor 2) кодирует белок семейства ингибиторов сериновых протеиназ Кунитца. Этот ген был идентифицирован как онкосупрессор. Метилирование промотора TFPI2 приводит к снижению его супрессорной функции. Биологический материал был собран у 11 пациентов с диагностированным раком толстой кишки разных отделов (прямая, сигмовидная, восходящая, нисходящая и даже слепая). Стадии онкозаболевания — в основном третья и четвертая, средний возраст пациентов — примерно 65 лет. В качестве контроля участвовали условно здоровые 10 человек. Только у одного из 11 пациентов был получен негативный результат, возможно, из-за погрешностей работы с образцом. Коллеги Татьяны обратили внимание, что это пациент с диагнозом «рак восходящей ободочной кишки», но тем не менее в выборке есть пациент с положительным результатом, у которого рак слепой кишки, то есть причина отрицательного результата не в местоположении новообразования. И только у одного условно здорового человека тест показал положительные результаты. Позже у него была выполнена колоноскопия, биопсия и выявлена тубулярная аденома low-grade, то есть предопухолевый процесс. Сейчас он находится под наблюдением. Также Татьяна Лисица с коллегами протестировала набор iColohunter на метилирование генов, выделенных из плазмы крови. Ген NTMT1(N-Terminal Xaa-Pro-Lys N-Methyltransferase 1) кодирует метилтрансферазу, участвующую в посттрансляционной модификации белков, участвующую в регуляции клеточного цикла и пролиферации. Метилирование промоторной области NTMT1 характерно для КРР, приводит к изменению экспрессии и способствует опухолевому росту. МАРЗК14-AS1 — это некодирующая РНК, антисмысловая к гену МАРЗК14, вовлеченная в сигнальные пути, связанные с воспалением и апоптозом. Исследователи сравнили результаты, полученные с помощью обоих наборов. Образец №4, который по тестированию образца фекалий вышел отрицательным, по тестированию плазмы получился положительным, а образец условно здорового человека на обеих тест-системах был положительным. Конкордантность есть, но правильнее использовать оба теста, подвела итог докладчица. Таким образом, метилирование ДНК зарекомендовало себя как перспективный и высокочувствительный маркер для ранней диагностики КРР. Изменения метилирования промоторов ключевых генов выявляются на ранних стадиях заболевания, что позволяет проводить скрининг до появления симптомов. Взаимодополняющие биологические материалы для неинвазивного тестирования — циркулирующая опухолевая ДНК из плазмы крови и ДНК, выделенная из фекалий. Неинвазивные тесты на основе метилирования ДНК активно внедряются в клиническую практику, отметила в заключение Татьяна Лисица. Благодаря удобству и эффективности они найдут применение как в массовом скрининге, так и в мониторинге пациентов с высоким риском КРР. Завершила сателлитный симпозиум Галина Вирясова, руководитель отраслевого маркетплейса Skyklad. Она отметила, что сама достаточно долго работала в лаборатории, поэтому с проблемами ученых знакома не понаслышке. Это и сложный поиск товаров, особенно если привычный бренд больше не поставляется в РФ и требуется искать аналог, и медленная доставка, и длительный документооборот, когда нужно вести параллельные переписки с разными компаниями, заключать договоры, проводить конкурсы. Научному сотруднику не очень хочется тратить время на поиски нужных позиций по десяткам сайтов. Решить часть этих проблем призван маркетплейс Skyklad. Сделать покупку можно просто через сайт, где всегда отображается актуальная информация о наличии товара и цене — это обязательное правило. На маркетплейсе отображаются только те реактивы, оборудование и расходные материалы, которые уже находятся на складах в нашей стране. Skyklad объединил торговые компании и российских производителей с покупателями по всей России. Возможна доставка как нетемпературных, так и температурных товаров. Многие сотрудники государственных учреждений спрашивают: «А как это проводить? Через отдел закупок?» Для научных институтов Skyklad сделал возможность легко подготовить онлайн коммерческое предложение. Оно сразу формируется на сайте, его можно скачать и отнести на согласование, в то время как выбранные товары будут поставлены в резерв: гарантия того, что за время оформления закупки товар не купит кто-то еще. Стоимость доставки считается автоматически. И даже если корзина собрана из товаров разных поставщиков, то контрагент на весь заказ будет один — компания Skygen, что очень удобно для отдела закупок в плане согласования документов и подготовки. Функционал площадки позволяет работать с физлицами, коммерческими компаниями и упомянутыми ранее государственными учреждениями. Заказ можно оплатить тремя способами. Оплата картой — самая быстрая возможность сделать покупку для физического лица. Оплата счета удобна для коммерческих компаний, потому что счет формируется онлайн, и как только счет оплачен, заказ начинают собирать. Кроме того, в этих двух случаях товар едет напрямую со склада поставщика к клиенту, а условия регулируются договором-офертой на сайте. Заказы в среднем приезжают в течение 3–7 дней после оплаты. Оплата через коммерческое предложение — это отдельный договор по требованию организации, поэтому такая закупка требует занимает больше времени. «Skyklad много работает над функционалом, чтобы пользователям было удобно», — отметила Галина Вирясова. В наличии имеются разные бренды, есть гибкая система скидок, которые появляются чаще всего из-за акций поставщиков или из-за короткого срока годности. На сайте можно купить и оборудование, и пластик, и реактивы. Фильтры позволяют сортировать каталог по разным категориям для быстрого поиска. В этом году существенно вырос раздел аналитической химии, хроматографии. Среди новинок — аналог системы очистки воды Millipore из Санкт-Петербурга: хорошая цена (от 220 тысяч рублей), бесперебойная техническая поддержка, все запчасти в наличии. На данный момент у Skyklad более 110 партнеров, поставщиков и производителей, разместивших своих складские позиции и регулярно обновляющих информацию о наличии и стоимости. «Если у вас есть желание перенести научную разработку в бизнес, то вы можете стать поставщиком Skyklad», — сказала Галина Вирясова. Вашим продуктом может быть питательная среда, клеточная линия, химический реактив (без прекурсоров), фермент или что-то еще. Например, в МФТИ есть несколько компаний, которые поставляют всего две-три позиции, но они пользуются спросом у коллег из других институтов. Skyklad быстро отвечает в любом формате — мессенджеры, звонки, почта — по любому вопросу. А в телеграм-канале публикуются новости и информация об акциях. Информация о докладчиках Гагарин Илья Михайлович, к.м.н., лаборатория молекулярной диагностики ГБУЗ «МГОБ №62 ДЗМ». Лисица Татьяна Сергеевна, врач-лабораторный генетик лаборатории молекулярно-генетической диагностики НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина, биолог разработки новых методов молекулярной диагностики заболеваний человека ФГБУ ЦСП ФМБА России. Вирясова Галина Михайловна, руководитель отраслевого маркетплейса Skyklad Реклама. Рекламодатель ООО «СКАЙДЖИН» ИНН 7705997147 Source: https://pcr.news/novosti/md-2025-satellitnyy-simpozium-kompanii-skygen/