Юлия Панченко Начал секцию Masoud Zamani-Esteki, Dr, Maastricht University, с докладом «Transforming reproductive medicine: the power of liquid biopsy, genomics and artificial intelligence». После оплодотворения происходит быстрое и склонное к ошибкам деление клеток — дробление, когда одни клетки могут получить лишнюю хромосому, другие — потерять. В результате получаются мозаики с нормальным и аномальным набором хромосом. Это важно учитывать при преимплантационном генетическом тестировании (ПГТ). Традиционное ПГТ специфично для локуса и для семьи. Иногда, чтобы разработать такой тест, необходимо 1–1,5 года. В Маастрихтском университете выполняется более 500 тестов. Та же проблема — с анализом митохондриальной ДНК (мтДНК). При мозаицизме возможна ситуация, когда при получении биопсии из разных мест эмбриона можно выявить различные типы анеуплоидий. Можно использовать SNP, чтобы реконструировать гаплотипы. В этом случае для ПГТ не нужно проводить специфичные для локуса и семьи тесты. Но даже если аллеля риска нет, возможно присутствие трисомий и моносомий. Так что был разработан метод b-allele frequency. Если применить этот подход к большому количеству клеток, например, образцу крови, легко оценить, какие присутствуют генотипы. Но при проведении полногеномной амплификации можно исказить результаты. Тогда используют генотипы родителей и с помощью подхода под названием haplarithmisis восстанавливают генотип ребенка. Так можно найти хромосомные аномалии и понять, когда эти аномалии произошли (до или после оплодотворения, митоза, мейоза). А на основе этой информации понять, будут ли нарушения во всех клетках эмбриона, или присутствует мозаицизм. Этот же подход можно применить к мтДНК. С докладом «Использование геномных методов и баз данных в диагностике моногенных форм мужского бесплодия» выступил Вячеслав Черных, д.м.н., ФГБНУ МГНЦ им. Н.П. Бочкова (соавтор: Соловова О.А.). Бесплодие отмечают в среднем у 7% мужчин и у 15–18% супружеских пар репродуктивного возраста. Частыми причинами тяжелых форм нарушения фертильности у мужчин и женщин, идиопатического бесплодия, привычного невынашивания беременности являются генетические факторы. В большинстве случаев генетические причины бесплодия остаются недиагностированными. «Мужской фактор» в большинстве случаев связан с наличием патозооспермии и обуславливает 40–50% случаев бесплодия (по данным ВОЗ). Для тяжелых форм патозооспермии характерна выраженная генетическая гетерогенность (более 2 тыс. генов, контролирующих сперматогенез и мужскую фертильность). Самая частая моногенная форма мужского бесплодия — это муковисцидоз. У мужчин бесплодие присутствует в 95% случаев. Это связано с нарушением проходимости семявыносящих путей. Но есть еще и форма аплазии семявыносящих протоков без муковисцидоза — CBAVD. Некоторые варианты встречаются при муковисцидозе, но не встречаются или редко встречаются у мужчин с CBAVD. Генов, которые отвечают за азооспермию и олигозооспермию тяжелой степени, очень много. Это требует использования геномных методов. В частности, группой докладчика была обследована выборка из 200 мужчин с бесплодием, у которых не были выявлены другие причины, негенетические или генетические, частые, такие как хромосомные аномалии, мутации генов, муковисцидоз и микроделеции в локусе AZF. И у 43 пациентов из 200 были выявлены 64 варианта, в том числе 4 структурные хромосомные перестройки, захватывающие отдельные гены или их части. Часть из них была подтверждена, но многие не были аннотированы. Преобладали миссенс-варианты, интронные варианты, сдвиги рамки считывания. Многие варианты не были ранее описаны. В том числе были выявлены несколько пациентов с синдромальными формами, которые ранее не были диагностированы. В некоторых случаях диагностика позволила снизить темп развития заболевания. Один из генов, в котором были выявлены варианты, — ген WNK3, который связан с синдромом Прието. Он клинически вариабельный, то есть может быть связан и только с мужским бесплодием. Оно может быть как обструктивным, так и необструктивным, в зависимости от генотипа. Синдромальные морфологические аномалии сперматозоидов — генетические формы мужского бесплодия, обусловленные специфическими дефектами спермиогенеза. Это крайне гетерогенное заболевание, известно больше 50 локусов. И использование электронной микроскопии в совокупности с секвенированием экзома или генома позволяет существенно повысить эффективность диагностики. Также важно отметить выраженную клиническую вариабельность при одной и той же мутации. Еще одна форма — это синдром «шаровидных головок», или глобулозооспермия. Такая аномалия препятствует оплодотворению естественным путем. Было показано, что при этой форме аномальных сперматозоидов может быть 30–40%, тогда фертильность резко снижена, но не исключена полностью. То есть тоже есть фенотипическая вариабельность. В ФГБНУ «МГНЦ» уже с 1990-х годов проводятся генетические исследования по поводу мужского бесплодия, набрано большое количество образцов пациентов с разными формами мужского бесплодия. Запатентованы базы данных пациентов с тяжелыми формами мужского бесплодия. Предложены алгоритмы обследование с использованием разных методов диагностики, в том числе с помощью высокопроизводительных методов секвенирования, которые позволяют повысить эффективность диагностики редких аллельных вариантов. Сохранение биологического материала позволяет обращаться к ним повторно. С докладом «Генетические базы данных как инструмент диагностики и прогноза репродуктивных потерь» выступил Андрей Глотов, д.б.н., ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии» им. Д.О. Отта (соавторы: Максютенко Е.М., Барбитов Ю.А., Насыхова Ю.А.). Порядка 20% семей сталкиваются с нарушениями репродуктивных функций, это влияет на демографические показатели. Наблюдается низкая рождаемость, высокая частота бесплодия и невынашивания беременности, отсроченное планирование деторождения. Все это негативно сказывается на репродукции в целом. Нужно создавать инструменты для профилактики этих патологий. Для того, чтобы такие инструменты работали, нужны большие выборки, большие коллекции и хорошо характеризованные базы данных. Важным инструментом для любых генетических технологий выступает взаимодействие между биобанком и различными геномными центрами. Биобанк — источник высококачественного материала, в рамках которого создаются базы данных. А базы данных — инструмент анализа и интерпретации, они позволяют выявлять закономерности, строить прогнозы и внедрять все это в персонализированную медицину. В мировой практике есть большое количество биобанков репродукции при крупных университетах и больницах, преимущественно небольшие коллекции в клиниках ВРТ и международный консорциум, включающий 24 центра. В России есть биобанк («Генофонд», ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии» им. Д.О. Отта с партнерами), лаборатория по сбору биоматериала (ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова») и общий биобанк в ТНМИЦ. Есть определенные коллекции, и это повод на базе этих коллекций создавать биобанки. Сегодня генетические базы, которые должны создаваться на основе биобанков, — это тот ключевой инструмент современной молекулярной диагностики, который позволяет интерпретировать результаты генетического анализа на основе накопленного опыта многих лабораторий. Существуют разные ресурсы: Orphanet, OMIM, ClinVar, gnomAD, HGMD и прочие, которые содержат миллионы записей о мутациях, частоте, типе наследования. Важным аспектом таких баз является то, что они должны быть курированы. Но, к сожалению, что касается задачи, связанной с репродукцией человека, то таких баз фактически нет. Вышеперечисленные базы очень специализированы, Orphanet полезен для клинической работы, в OMIM врачи-генетики и молекулярные биологи смотрят информацию о различных фенотипах, ClinVar и HGMD используют для интерпретации вариантов, gnomAD — для популяционных частот. Что касается репродукции человека, то есть Infertility Disease Database — это новая, вручную курируемая база данных генов, связанная с бесплодием. Она создавалась для изучения биологических аспектов бесплодия. Есть база данных, посвященная мужскому бесплодию (Male Infertility Knowledgebase). Это консолидированный ресурс по генам, связанным с различными нарушениями, приводящими к мужскому бесплодию. Она курируется вручную на предмет ассоциации генов с бесплодием. Можно выделить также Human Intolerome Database. Эта база систематизирует гены и варианты, ассоциированные с эмбриональной летальностью и неонатальной смертностью, добавлено 16 исследований. Она объединяет информацию ClinVar, OMIM и gnomAD и полезна для выявления потенциально летальных и патогенных мутаций при потере беременности. Но пока эта база еще находится в стадии препринта. Пока неясно, можно ли этой информацией с уверенностью пользоваться в клинической практике. Есть и уже не поддерживаемые базы данных, например, Baby Bio Bank, The Database for Preterm Birth, Database for Preeclampsia. Нельзя быть уверенными, что эти базы содержат наиболее актуальную информацию, ими нельзя пользоваться. Когда создавали биоресурсные коллекции, заранее говорили о необходимости постоянной поддержки этой коллекции, этой базы данных. Сбор биологических образцов, проведение собственных исследований, заполнение собственными результатами базы данных — это один из важных инструментов по наполнению таких ресурсов. Есть несколько проектов, например, проект «Компас», связанный с пациентами, планирующими беременность, после установления причины, ассоциированной с репродуктивными потерями в первом триместре. Все это вело к тому, что собственные и международные проекты должны быть объединены в один источник, который позволит оперативно сопоставить найденный вариант с ранее уже описанными случаями, оценить его патогенность, вероятность влияния на развитие эмбриона и дальше интегрировать это в профилактические и прогностические модели. Таким образом пришли к созданию собственной базы данных базы данных — PLoV (от Pregnancy Loss genetic Variant database). Это открытая база данных; на сегодняшний день она содержит информацию о 47 исследований с использованием различных стратегий анализа (например, анализ генома плода, трио-анализ или анализ только родителей). В большинстве случаев эта информация связана с привычным невынашиванием беременности, меньшее число случаев относится к единичным событиям потери беременности. Генетические данные рассредоточены по всем хромосомам человеческого генома и обнаружены в 292 уникальных генах. В базе содержится информация о 534 генетических вариантах, самая большая группа — это патогенные и вероятно патогенные варианты с общей долей 48,7%, за ними следуют варианты неопределенной значимости. Больше всего мутаций происходит в генах, участвующих в морфогенезе, формировании плаценты, дифференцировке клеток, регуляции сигналинга, то есть во всех процессах, которые критически важны для эмбрионального развития. База является курируемой. Вскоре в нее будет добавлена информация о 123 вариантов из новых статей, которые были накоплены за последние полгода. Схема базы данных включает четыре основные таблицы: варианты, случаи, исследования и наблюдения. Таблицы содержат детализированную описательную информацию о варианте и случаях/семьях, в которых он был найден. Каждый вариант имеет свой ID и связывает определенную нуклеотидную замену с конкретным случаем (семьей). Каждый случай имеет собственный Case ID, связанный с вариантами, с использованием таблицы Observations, что позволяет исследователям отслеживать генотипы родителей и плода. Из раздела случаев с помощью Study ID можно получить информацию о конкретном исследовании, в котором описан данный случай. Пользователи могут отправлять данные о генетических вариантах и предлагать опубликованные статьи, то есть база является открытой. Но вся предоставленная информации будет анализироваться кураторами. Для чего все это нужно? Для диагностики: имеется фактически полная характеристика варианта, можно сопоставить его с ранее описанными случаями и использовать эту информацию для прогноза потери беременности и для формирования определенных групп риска, создания таргетных панелей для тестирования в этой семье или для анализа на этот вариант с репродуктивными потерями. Также база важна для поддержания контроля качества исследования. Ключевым результатом подобных работ является вхождение баз данных как неотделимого элемента молекулярной диагностики. База данных — это тот инструмент, на основании которого ставится конечный диагноз, поэтому чем лучше наполнена база, тем более точен будет диагноз. База данных PLoV была использована для интерпретации геномных данных 70 трио из биобанка «Генофонд», что позволило выявить клинически значимые варианты и подтвердить ее эффективность как инструмента диагностики и анализа причин невынашивания беременности. Доклад «Эпигенетические маркеры анеуплоидии при невынашивании беременности» прочитала Оксана Васильева, НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ. Около половины всех спонтанных абортусов в первом триместре беременности имеют аномалии кариотипа. Известно, что аномалии у человека и млекопитающих в основном связаны с эмбриональной летальностью. При этом эффекты анеуплоидии зависят от различных хромосом. У человека эмбриональная летальность происходит в основном в одно и то же время — первый триместр беременности, что указывает на наличие в этом периоде критичного важного этапа для развития эмбрионов. Однако еще не до конца известны все механизмы, которые приводят к эмбриональной летальности. Главную роль в процессе, приводящему к эмбриональной летальности, играют различные эпигенетические факторы; одним из главных факторов является метилирование ДНК. Известно, что периоды снижения уровня метилирования генома совпадают с возрастанием частоты анеуплоидии. Анеуплоидия может приводить к масштабным изменениям эпигенома, а масштабные эпигенетические нарушения в плаценте могут быть связаны с гибелью эмбриона. Среди спонтанных абортусов с анеуплоидией наиболее часто встречаются трисомия по 16-й хромосоме и моносомия Х. Уже проведено много работ по изучению метилирования генома при анеуплоидии в различных типах клеток, но клетки трофобласта спонтанных абортусов до сих пор очень слабо изучены. Важная роль эмбриональной части плаценты для развития эмбриона обуславливает то, что необходимо изучать метилирование генома в ворсинах хориона спонтанных абортусов. Группа докладчицы отобрали образцы ворсин хориона у спонтанных абортусов первого триместра беременности с моносомией X и трисомией по 16-й хромосоме, а также медицинские абортусы. Кариотипирование было проведено с помощью стандартного метода для культуры фибробластов, также было подтверждено с помощью FISH родительское происхождение моносомии X. STR-анализ подтвердил отсутствие контаминации материнской тканью ворсин хориона. Для анализа профиля метилирования использовали такие методы, как RRBS и метилочипы. Далее проводили подтверждающий анализ для более интересных генов с помощью таргетного бисульфитного NGS на более расширенных выборках. При анализе метилочипов для трисомии 16-й хромосомы было выявлено более 90 гиперметилированных генов. Среди них были обогащены гены секретируемых белков. У четырех генов — ANKRD53, GATA3-AS1, TRPV6 и SLC13A4 — был значительно повышен уровень метилирования по сравнению с медицинскими абортусами. Один из проанализированных гиперметилированных генов — GATA3-AS1 — усиливает экспрессию ключевого фактора транскрипции GATA3, который контролирует дифференцировку трофобласта. Проведя иммуногистохимический анализ, увидели, что уровень экспрессии белка GATA3 был снижен у спонтанных абортусов с трисомией 16 по сравнению со спонтанными абортусами с нормальным кариотипом. Далее провели анализ для спонтанных абортусов с моносомией Х. Моносомия Х характеризуется широкой фенотипической вариабельностью — от спонтанных абортусов до относительно слабых симптомов синдрома Шерешевского — Тернера; 99% эмбрионов с моносомией Х погибают в первом триместре беременности, при этом частота синдрома составляет от 1 на 2500 до 1 на 3000 живорожденных. Анализ показал, что у спонтанных абортусов с моносомией Х выявляются тысячи дифференциально метилированных сайтов. Родившиеся индивиды с синдромом Шерешевского — Тернера имеют женский пол в связи с отсутствием хромосомы Y. Однако спонтанные абортусы с моносомией сильнее отличались от медицинских абортусов женского пола, чем от медицинских абортусов мужского пола. Логично предположить, что это было связано с инактивацией второй X-хромосомы. Но это не так, потому что всего лишь 5,5% DMS от общего числа выявленных DMS были на X-хромосоме. Также не было выявлено обогащения DMS на отдельных хромосомах, они преимущественно находятся вдали от генов. DMS обогащены в субтеломерных регионах хромосом, а также в локусах LAD, LINE и SINE. Далее выявили гены, которые имели DMS в промоторах, и получили список из 831 дифференциально метилированного гена для группы сравнения спонтанных абортусов с моносомией X по сравнению с медицинскими абортусами женского пола и 254 дифференциально метилированных генов в группе сравнения моносомии X с медицинскими абортусами мужского пола; 48 генов были дифференциально метилированы при сравнении спонтанных абортусов с моносомией X материнского и отцовского происхождения с медицинскими абортусами обоих полов. Из них функции 21 гена были связаны с эмбриональным развитием, а нокаут семи генов у мышей приводил к эмбриональной летальности по базе данных «Mammalian Phenotype». Далее взяли гены, у которых уровень метилирования превышал 40%, и этот список сравнили со списком дифференциально метилированных генов у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом. Получили всего три гена, которые были уникальны именно для спонтанных абортусов с моносомией X. Получили кластеры белков и увидели, что гены в кластере, выявленном при сравнении с эмбрионами с кариотипом 46XX, ассоциированы преимущественно с функцией аппарата Гольджи. А кластер генов, которые показали дифференциальное метилирование по сравнению с абортусами с кариотипом 46XY, был связан с врожденными пороками сердца и крупных сосудов. Интересно, что патогенные варианты в гене PKD1, которые были гиперметилированы у спонтанных абортусов с моносомией X, приводят к поликистозной болезни почек, которая часто встречается при синдроме Шерешевского — Тернера. Далее провели таргетный анализ для шести генов и увидели, что в хорионе спонтанных абортусов с моносомией X был значимо гиперметилирован ген ALCAM и гипометилирован ген BDH1. Часть генов отличалась повышенной вариабельностью как у медицинских, так и у спонтанных абортусов. А нарушения метилирования наблюдались, как правило, по нескольким генам одновременно. На каком же этапе пренатального развития происходят выявленные нарушения метилирования? Для ответа на этот вопрос провели сравнительный анализ, используя открытые датасеты, из которых взяли уровень метилирования у нормальных сперматозоидов, яйцеклеток, трофэктодермы бластоцисты, а также трофобласта хорина первого и третьего триместра. Сравнив эти группы между собой, выявили гены, которые в норме меняют свой уровень метилирования на том или другом этапе эмбрионального развития. Далее сравнили полученные данные по дифференциально метилированным генам у спонтанных абортусов с моносомией X по сравнению с генами, которые в норме изменяют свой уровень метилирования на определенных этапах эмбрионального развития. И получили, что большая часть генов, дифференциально метилированных у спонтанных абортусов с моносомией X, в норме изменяют свой уровень метилирования трофобластов первого триместра беременности по сравнению с трофэктодермой бластоциста. Получается, что большая часть нарушений метилирования при моносомии X происходит на стадии развития от бластоциста до первого триместра беременности. По словам докладчицы, эти данные еще следует подтверждать. «Эпигенетическая регуляция альтернативных промоторов генов в плаценте при невынашивании беременности» Екатерина Толмачева, к.б.н., НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ (в соавторстве с Марией Жилкиной, м.н.с.) В половине случаев при выкидыше эмбрион имеет нормальный кариотип. И тут могут быть разные причины прерывания беременности и эмбриональной гибели. Это аутоиммунные факторы, эндокринные нарушения, материнские факторы и анатомические факторы у матери. Но около 15% из этих причин необъяснимы. Группа докладчицы предположила, что одной из важных причин в этой группе могут быть нарушения нормального функционирования ретротраспозонов, которые составляют очень большую часть человеческого генома и очень важны на ранних этапах развития. В докладе речь пойдет о LINE-1, единственном автономно активном транспонированном элементе, который составляет около 17% всего генома. LINE-1 имеет промотор, который делится на две части. Это смысловой промотор, который запускает транскрипцию тех белков, которые необходимы для транспозиции, и антисмысловой промотор, который может управлять транскрипцией химерного элемента — 5’-антисмысловых последовательностей L1, сплайсированных с экзонами соседних генов. Наряду с каноническим может быть альтернативный промотор. Альтернативные промоторы и химерные транскрипты, которые они продуцируют, играют важные роли при развитии опухоли, и экспрессируются в разных тканях человека, но роль их и их экспрессия в плаценте человека практически не изучены. Группа докладчицы изучила роль этих транскриптов в нормальной плаценте для того, чтобы потом выявить нарушения, которые происходят у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, как причину эмбриональной гибели. Взяли медицинские абортусы первого триместра беременности, их было 9, и провели полнотранскриптомный анализ, выделили нуклеотидные последовательности транскриптов, которые имеют вставку LINE, проанализировали разницу между экспрессией с канонического промотора, то есть до LINE, и экспрессию после LINE. Выделили 222 гена. Далее проанализировали лейкоциты крови, в этих двух тканях очень сильно отличается уровень метилирования. Здесь выделили 92 гена, после этого сравнили эти 222 и 92, и нашли 172 гена, которые специфически экспрессируются плацентой. LINE разделяется на множество семейств, специфичные для человека и приматов вообще. В плаценте экспрессируются все семейства, которые характерны для приматов и человека, примерно в той пропорции, в которых они и наблюдаются в геноме. Далее исследователей заинтересовало, каким образом соотносится экспрессия с канонического промотора гена и с альтернативного промотора LINE в гене. Было показано, что химерные транскрипты могут как повышать, так и понижать транскрипцию самого гена с канонического промотора. Это зависит от ткани, от расположения и так далее. Обнаружили, что у 5609 транскриптов наблюдалась сильная положительная корреляция между транскрипцией с канонического и альтернативного промотора. Посмотрели, каким образом связана экспрессия с альтернативного промотора в зависимости от положения этой вставки в самом гене. И оказалось, что наиболее сильно экспрессируются химерные транскрипты в том случае, когда вставка находится в первой зоне. И чем дальше находится вставка, тем экспрессия была слабее. После этого провели анализ функциональных связей тех самых 172 генов и выявили несколько кластеров. Это кластер гена MET, который активирует PTK2 сигналинг, важный кластер, связанный с геном KIF7, и кластер, связанный с кальциевыми каналами. Это пути, которые регулируют рост клеток, подвижность, выживаемость, фокальную адгезию, и другие важные процессы. LINE-1 гиперметилирован у спонтанных абортусов с трисомией аутосом и моносомией X и у части спонтанных абортусов с нормальным кариотипом. При этом 15,7% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом имеют нарушения уровня метилирования LINE-1 (12,3% — повышение метилирования, 3,4% — снижение метилирования). Предположили, что в случае нормального развития, когда понижается метилирование промотора LINE-1, происходит транскрипция плацентоспецифичных транскриптов с альтернативного промотора и идет нормальное развитие плаценты. В случае повышения метилирования промотора LINE-1 понижается транскрипция плацентоспецифичных транскриптов с альтернативного промотора, это может привести к гибели эмбриона. Информация о докладчиках: Masoud Zamani-Esteki, Dr, Maastricht University, the Netherlands Вячеслав Борисович Черных, д.м.н., ФГБНУ МГНЦ им. Н.П. Бочкова, г. Москва Андрей Сергеевич Глотов, д.б.н., ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии» им. Д.О. Отта, г. Санкт-Петербург Оксана Юрьевна Васильева, НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ, г. Томск Екатерина Николаевна Толмачева, к.б.н., НИИ медицинской генетики, Томский НИМЦ, г. Томск Source: https://pcr.news/novosti/md-2025-reproduktsiya-cheloveka-bazy-dannykh-v-fokuse-geneticheskoe-zdorove-budushchikh-pokoleniy/