Елена Клещенко Известно более 7000 редких заболеваний, от которых страдает в общей сложности 300 миллионов человек в мире. При этом одобренные методы лечения существуют примерно для 5% этих состояний. Около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину, и многие из них связаны с нонсенс-мутациями, которые вызывают преждевременное прекращение синтеза белка. Нонсенс-мутации составляют 24% патогенных аллелей в базе данных ClinVar. Исследователи из Института Бродов под руководством Дэвида Лю, пионера в области редактирования генома, описали в Nature оригинальный подход к генной терапии таких заболеваний, при котором редактируется не участок гена с мутацией, а тРНК. Матричные РНК (мРНК) кодируют аминокислотные последовательности белков, причем каждый нуклеотидный кодон (триплет) соответствует определенной аминокислоте. Стоп-кодоны, или нонсенс-кодоны выполняют другую функцию: когда рибосома доходит до такого кодона, она прекращает синтез белка (происходит терминация). Нонсенс-мутации возникают, если замена нуклеотида в кодоне аминокислоты превращает его в стоп-кодон, который в этом случае называется преждевременным терминирующим кодоном (ПТК). Его появление запускает нонсенс-опосредованный распад мРНК. Но если мРНК с ПТК избегает распада, на такой матрице синтезируется укороченный белок с нарушенной функцией, что может привести к патологии. Распознавание кодонов, кодирующих аминокислоты, обеспечивают транспортные РНК (тРНК), доставляющие аминокислоты в рибосому. Нонсенс-кодоны, естественно, не имеют тРНК. Авторы новой статьи в Nature использовали метод редактирования генома, чтобы преобразовать обычную тРНК в супрессорную тРНК (суп-тРНК), которая распознает преждевременный стоп-кодон, связывается с ними и добавляет аминокислоту в белковую цепь. Это позволяет избежать обрыва цепи. Ранее уже предлагались терапевтические подходы, основанные на «подавлении нонсенса» (nonsence suppression) и восстановлении продукции полноразмерного белка. Например, важную роль в распознавании стоп-кодонов играет комплекс белков eRF1 и eRF3. Белок eRF1 связывается с кодоном в акцепторном центре рибосомы. (Акцепторный центр распознает молекулы тРНК, несущие аминокислоты, а этот белок имеет с тРНК частичное структурное сходство.) В свою очередь, eRF3 вызывает конформационные изменения в eRF1, которые приводят к высвобождению белка из рибосомы. Для лечения генетических заболеваний, вызванных нонсенс-мутациями, предлагалось, например, снизить концентрации eRF1 и eRF3 в клетках (это ослабляет распознавание стоп-кодонов, как показали российские ученые ). Но терапевтических средств на подобной основе пока нет. Иногда тРНК, способная образовывать пары оснований с двумя из трех нуклеотидов стоп-кодона (ПТК), вытесняет с него eRF1, и происходит добавление аминокислоты к растущей белковой цепи. Этот процесс, называемый «прочтением» (readthrough), приводит к трансляции полноразмерного белка. Что интересно, нормальные стоп-кодоны менее подвержены прочтению, чем ПТК — вообще, чем ближе стоп-кодон к 3’ концу мРНК, тем больше вероятность терминации. Отсюда возникла идея о терапевтическом использовании: можно создать систему, которая обеспечивала бы прочтение ПТК, но не обычных стоп-кодонов. Продукция белков избыточной длины, не терминированных вовремя, также нежелательна. тРНК, распознающие два нуклеотида в ПТК, можно искусственно модифицировать для распознавания всех трех нуклеотидов и получить таким образом суп-тРНК. Но их применению в клинике препятствуют с ложности с доставкой нуклеиновых кислот в клетки, которая будет необходима на протяжении всей жизни пациента. А повышение экспрессии суп-тРНК, как предполагается, может привести к дефектной трансляции всех белков и цитотоксичности. Авторы новой работы назвали свою стратегию «прочтение, опосредованное прайм-редактированием» (prime-editing-mediated readthrough, PERT). Прайм-редактирование разработано в лаборатории Лю еще в 2019 году — CRISPR-редактирование в нем дополнено использованием фермента обратной транскриптазы и особой РНК (pegRNA), которая и нацеливает Cas на мишень, и служит матрицей для редактирования. В ходе скрининга тысяч вариантов всех 418 человеческих тРНК авторы идентифицировали высокоактивную суп-тРНК, которая распознает ПТК с нуклеотидной последовательностью UAG. Затем авторы с помощью прайм-редактирования внесли исправления в ген этой тРНК в человеческих клетках in vitro. Исправления вносили в антикодон и таким образом получали оптимизированную суп-тРНК. Поскольку у человека много генов тРНК, такое изменение должно быть хорошо переносимым. В клетках, имеющих ПТК в генах, ассоциированные с различными заболеваниями (болезнь Баттена, болезнь Тея-Сакса и болезнь Ниманна-Пика типа C1), PERT восстанавливал 20–70% нормальной функции белка, кодируемого мРНК с преждевременным UAG. Авторы также протестировали PERT на мышиной модели лизосомной болезни накопления — мукополисахаридоза I (МПС I), также известного как синдром Гурлер . При этом заболевании появление кодона UAG устраняет экспрессию α-L-идуронидазы, фермента, расщепляющего гликозаминогликаны. Через семь недель после лечения PERT в мозге, печени и селезенке мышей активность α-L-идуронидазы достигла примерно 8% от нормальной, что снизило вредоносное накопление гликозаминогликанов и уменьшило признаки заболевания. PERT in vitro не вызывал нецелевого редактирования генов, не изменял уровни транскрипции нецелевых генов, не влиял на протеом и на гомеостаз тРНК в клетках. В обработанных PERT клетках или тканях мышах также не было обнаружено считывания нормальных стоп-кодонов. Преимущество новой технологии в том, что одна и та же редактирующая терапия может применяться при многих заболеваниях, вызванных стоп-кодоном UAG в гене того или иного белка. «Мы воодушевлены возможностью создания препарата на основе одного редактирующего агента, который может помочь многим различным типам пациентов, избежав необходимости тратить годы и миллионы долларов на разработку нового генетического препарата для каждого отдельного человека», — говорит Дэвид Лю. По его словам, «наблюдение за тем, как компании, занимающиеся редактированием генов, принимают непростые решения о том, какие цели преследовать, — а также непростые решения о том, каких пациентов оставить без внимания, — ясно показало, что нам нужны творческие научные подходы к решению некоторых из этих проблем». Чтобы проверить, насколько широко может быть применен PERT, авторы разработали in vitro анализ для количественной оценки способности суп-тРНК считывать UAG в различных мРНК. При скрининге 14 747 кодонов UAG в естественных последовательностях мРНК средний показатель считывания составил 69%. PERT обеспечивал прочтение 15 вариантов ПТК в мРНК, транскрибированных с вариантов гена CFTR, мутации в котором приводят к муковисцидозу. При этом удавалось восстановить до 14% нормальной экспрессии белка CFTR. Авторы подчеркивают, что природные и экзогенные суп-тРНК могут экспрессироваться без видимой токсичности в эукариотических клетках, поскольку существуют множественные механизмы, препятствующие прочитыванию естественных стоп-кодонов и появлению избыточно длинных белков Следует отметить , что аминокислота, вставленная в растущую белковую цепь во время прочтения ПТК, тоже может оказывать неблагоприятное влияние на функцию белка. Кроме того, понадобятся суп-тРНК, обеспечивающие считывание других ПТК — UAA и UGA. Подход, основанный на редактировании природных тРНК, снимает проблему с доставкой в клетки: после редактирования суп-тРНК может постоянно экспрессироваться в организме. Однако необходимо проверить, действительно ли экспрессия стабильна и не вызывает ли побочных эффектов. Кроме того, при многих генетических заболеваниях частичного восстановления активности фермента недостаточно. Source: https://pcr.news/novosti/praym-redaktirovanie-gena-trnk-smyagchaet-posledstviya-nonsens-mutatsii/