Вася Терещук Что нужно для обеспечения массового HLA-типирования доноров гемопоэтических стволовых клеток и как с этим обстоит дело в России? Как снизить риск заражения цитомегаловирусом — одного из основных инфекционных осложнений при гемотрансфузиях? Насколько часто на практике необходимо генотипирование эритроцитов? Почему ксенотрансплантация может опередить альтернативные методы замены органа и каковы ее перспективы? Ответы на эти и другие важные вопросы прозвучали на конференции «Молекулярная диагностика 2025» в секции трансфузиологии и трансплантологии. Изображение: Председатели секции профессор Евгений Борисович Жибурт (ФГБУ «НМХЦ им. Н.И. Пирогова») и д.б.н. Мария Александровна Логинова (ФГБУН КНИИГиПК ФМБА, г. Киров). Фото: Вася Терещук Открывающий секцию доклад «Особенности массового HLA-типирования доноров гемопоэтических стволовых клеток» прочитала Мария Логинова, д.б.н., ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, г. Киров. Наиболее крупная задача, стоящая при HLA-типировании — это формирование регистра потенциальных неродственных доноров костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Также оно необходимо для оценки иммунологической совместимости донора и реципиента при трансплантации органов, выявления предрасположенностей к некоторым патологиям, диагностики причин невынашивания. Первого сентября 2022 был создан Федеральный регистр доноров. На момент создания в него вошли 112 тысяч доноров, независимо от того, по какому числу локусов и в каком разрешении они были типированы. За три года объем регистра увеличился втрое (до 350 тысяч человек), и сейчас стоит цель собрать миллион потенциальных доноров. При этом по современным требованиям для включения в регистр необходимо HLA-типировать доноров в высоком разрешении по пяти локусам. Сейчас 75% неродственных трансплантаций выполняются от доноров из регистра — это огромная мерка по мировым цифрам, так что регистр в России, пусть он и не очень велик, работает крайне эффективно. Все современные технологии HLA-типирования относятся к молекулярным, хотя некоторые лаборатории все еще используют серологический анализ в отдельных случаях. NGS — оптимальная на сегодняшний день технология массового HLA-типирования. Одно из обязательных требований к данным типирования — это исключение нулевых аллелей в любых участках, где бы эти аллели ни локализовались. Это становится проблемой для лабораторий, пока не работающих с новыми аллелями (особенно в случае HLA-II). В популяции есть известные не разрешаемые неоднозначности по генотипу, и содержащие их данные в регистр вносить нельзя. Поэтому требуется дополнительная технология, которая все же позволит эти неоднозначности разрешать. Важно также учитывать, что современные мировые каталоги не рассчитаны на особенности российских популяций — частоты встречаемости определенных редких аллелей в России и в мире в целом могут сильно разниться. Отдельную сложность представляет выявление большого количества новых аллелей у жителей РФ. У кого-то это случайные мутации, но достаточно много — минимум 15-20 аллелей, например, C02:151, — циркулируют в российской популяции и требуют регистрации. И частота выявления новых аллелей в РФ весьма высока — примерно 1 на 300-400 чел. По данным на 9 апреля 2025 года, на регистрацию было подано 822 варианта. В кировском НИИ гематологии было зарегистрировано 458 новых аллелей. При этом 340 из них содержат кодирующую замену, а 160 таких замен расположены в ключевых экзонах — то есть непосредственно влияют на распознавание «свой-чужой». В целом самое большое число зарегистрированных аллелей находятся в наиболее вариабельном локусе — HLA-B. Таким образом, технологии для HLA-типирования развиваются, но если поток большой, то лаборатории необходимо поддерживать несколько различных технологий, в том числе секвенирование по Сэнгеру как «золотой стандарт», дополняющий NGS. Кроме того, развитие технологий и активное наполнение базы данных ставит необходимость регулярно повышать квалификацию специалистов. Это связано с тем, что номенклатура регулярно меняется — например, если аллель с помощью более совершенных методов переклассифицируют из нулевого в вариант с низкой экспрессией, его придется начать учитывать при подборе доноров. Елена Киселева, сотрудница Самарской областной клинической станции переливания крови, выступила с докладом «Частота выявления маркеров цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) среди доноров Самары и Cамарской области». ЦМВИ — частое инфекционное осложнение у реципиентов ГСК и гемотрансфузий. При этом в России обследование на ЦМВ не входит в перечень обязательных исследований для доноров, тогда как доля серопозитивных взрослых составляет, по разным оценкам, от 73 до 98%. Существует несколько стратегий снижения риска, к которым относятся тестирование на маркеры ЦМВ и использование для трансплантации серонегативных компонентов. Исходя из этого, была поставлена цель создать запас таких компонентов и проанализировать частоты распространения маркеров среди доноров Самары и Самарской области. Сбор данных для анализа биомаркеров осуществляли с декабря 2024 по январь 2025 года, в исследование включили 141 донора тромбоцитов и 767 доноров крови. Обследование проводили в четыре этапа. После отбора образцов и формирования выборки для скрининга на маркеры ЦМВИ для каждого донора определяли его серологический статус путем иммуноферментного анализа на IgG- и IgM-антитела, а также выявляли ДНК цитомегаловируса методом ПЦР. Следующим этапом был выбор доноров. Оптимальным является вариант серонегативного статуса, то есть случай, когда в крови донора не обнаруживаются ни IgG, ни IgM к ЦМВ, а также отсутствует вирусная ДНК. Допустим также вариант серопозитивного донора без активации, то есть при наличии в крови IgG, но не IgM к вирусу. ДНК вируса в таком случае также детектироваться не должна. В исследуемой выборке сероненативных доноров оказалось 10,7% (97 человек из 908). При этом вирусная ДНК не была выявлена ни в одном случае, что подтверждает отсутствие виремии на момент обследования. Результаты скрининга позволяют создать специализированный банк ЦМВ-негативных гемокомпонентов. В первую очередь это важно для иммунокомпрометированных реципиентов, для которых риск ЦМВИ как осложнения после гемотрансфузии особенно высок. Подтверждение серонегативного статуса доноров повысит безопасность гемотрансфузий, что потенциально улучшает прогноз для таких пациентов. Доклад на тему «NAT в иммуногематологии» прочитала Анна Чумак, к.м.н., зав.кафедрой HLA-типирования в Центре крови имени О. К. Гаврилова. Постановление Правительства РФ от 14.05.2025 №641 регламентирует правила создания запасов донорской крови и ее клинического использования. В этом постановлении появился пункт 90, который гласит, что к эритроцитам допускается применение методов генотипирования. Генотипирование групп крови, то есть определение генов, кодирующих поверхностные антигены, проводится с опорой на установленную Международным обществом переливания крови номенклатуру аллелей. Для этой задачи применяют две группы методов — детекция отдельных полиморфизмов, выявления которых достаточно для большинства рутинных случаев, и секвенирование по Сэнгеру или методами NGS в более сложных ситуациях. К сложным случаям, для разрешения которых может применяться генотипирование, относятся формирование химеризма, в том числе приобретенного после гемотрансфузий, наличие у реципиента аутоантител или слабых антигенов или несоответствие результатов прямой и обратной реакции в серологическом анализе. Последнее, между прочим, не самая редкая ситуация. Выявление таких случаев необходимо для того, чтобы обеспечить безопасность реципиента после трансфузии. Возможные решения для этого — использование для переливания антигеннегативных компонентов или их выбор с учетом шкалы приоритетов трансфузионно опасных антигенов. Насколько часто может потребоваться генотипирование групп крови? По данным, предоставленным Морозовской ДГКБ, в 2023 году более 18% трансфузий получили пациенты, у которых нельзя было однозначно интерпретировать группу крови. Преимущественно им переливали антигеннегативные компоненты. Генотипирование не избавит от таких случаев полностью, но позволит снизить риски и рациональнее расходовать компоненты крови. Другой важный случай, в котором есть смысл проводить генотипирование — это выявление антигена D по резус-системе при беременности (генотипирование RHD). Определение D-статуса плода и матери необходимо для профилактики алло-D-иммунизации и для прогнозирования риска гемолитической болезни плода и новорожденного (ГПБН). Однако варианты антигена D могут влиять на результаты количественного и качественного анализа. Их затруднительно выявить серологическими методами, например, вариант слабого D-антигена (Dweak) снижает его экспрессию на поверхности эритроцитов — это приводит к риску получить ложноотрицательный результат при серологическом тестировании. Поэтому реципиентам при гемотрансфузиях и беременным женщинам с Dweak рекомендовано генотипирование RHD. Парциальные варианты D, напротив, могут демонстрировать сильную агглютинацию. Пациентам с таким фенотипом показано переливание D- компонентов крови, однако выраженная агглютинация может привести к неверному определению фенотипа и назначению D+ для трансфузии. Однако все перечисленные рекомендации распространяются именно на реципиентов — генотипирование доноров в РФ пока что находится за пределами правового поля. Однако наличие регистра доноров с редкими фенотипами групп крови также было бы крайне ценно для трансфузиологии. Вопросы выявления резус-статуса более подробно раскрыла Олеся Пшеничникова, к.б.н., ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, в своем докладе «Значение генотипирования для диагностики сложных вариантов резус-фактора». Резус-система — это вторая по значимости и самая сложная система групп крови, содержащая 56 антигенов. Они кодируются двумя генами — RHD и RHCE. Их редкие варианты встречаются приблизительно у 1% населения — это слабый, парциальный и Del-варианты антигена D. Последний невозможно выявить серологически, остальные, как уже говорилось, могут представлять серьезные трудности, но генотипирование поможет решить эту проблему. Примером служат два клинических случая выявления редких вариантов, которые образовались в результате гибридизации генов RHD и RHCE. В первом случае пациентка обратилась в НМИЦ гематологии за определением группы крови перед переливанием. Анализ с помощью гелевых карт показал фенотип ccDweakE, но генотипирование методом аллельспецифичной ПЦР не дало однозначного результата. По этой причине кровь пациентки направили на секвенирование по Сэнгеру. Молекулярно-генетический анализ выявил редкий гибридный вариант — ген RHD содержал гомозиготные варианты, специфичные для гена RHCE. Такой вариант классифицируется как парциальный, хотя в изначальном анализе он был интерпретирован как Dweak. В соответствии с установленным фенотипом трансфузионную практику скорректировали, и пациентка получила эритроциты донора с фенотипом ccddee. У другой пациентки серологический анализ также показал неоднозначные результаты на антиген D. Результаты секвенирования по Сэнгеру показали, что у пациентки отсутствуют экзоны 2–9 гена RHD. Это пример геноконверсии, когда центральная часть данного гена заменена на участок RHCE. Локус RHD в таком случае нефункционален, и фенотип пациентки классифицируется как dd. Оба примера наглядно подтверждают, что в сложных случаях только прямое секвенирование RHD и RHCE помогает установить фенотип и обеспечить безопасность трансфузии. Александра Зубкова, м.н.с. Сеченовского университета, прочитала доклад на тему «Анализ модификаций генома свиней, использованных для ксенотрансплантации». Проблема дефицита донорских органов в современном мире стоит остро. Менее половины пациентов из списка ожидания получают необходимый орган, в России пересадки дожидаются около 20%. Органы, потребность в которых для трансплантации наиболее высока — это почки, печень и сердце. При этом количество новых доноров не удовлетворяет эту потребность — в 2024 году их было зарегистрировано 1365. Средний срок ожидания составляет 3–5 лет. Для того, чтобы пациент смог дожить до трансплантации, существует несколько решений. Одно из них — ex vivo перфузия, поддерживающая функции органа, однако время ее применения ограничено. Другой вариант — создание мини-органов из собственных ИПСК пациента, но современные технологии не позволяют получать полностью функциональные и зрелые структуры, которые смогли бы стать полноценной заменой органу. Технология 3D-биопечати также перспективна, но недостаточно развита. Наконец, четвертым вариантом является ксенотрансплантация, то есть использование для донорства животных другого вида. Она сопряжена с риском отторжения и передачи зоонозных инфекций, однако жизнеспособность ксенотрансплантатов в теле человека уже подтверждена клиническими испытаниями. Первыми животными-кандидатами для ксенотрансплантации были приматы, однако первые клинические случаи всегда заканчивались отторжением, и в США эту концепцию полностью запретили еще до начала экспериментов. Другим перспективным источником органов оказались свиньи ввиду достаточного анатомического сходства органов и более низкого, чем в случае приматов, риска передачи зоонозов. В 1997 году была проведена первая пересадка органа от дикой свиньи человеку, которая, правда, не получила официального одобрения. Однако риск иммунологического отторжения органов свиньи выше. Для решения этой проблемы уже разработан ряд генетических модификаций: это тройной гомозиготный нокаут углеводных антигенов свиньи и интеграция некоторых человеческих генов, снижающих иммунный ответ. Сейчас существует три основных генетических варианта свиней, полученных с помощью такими модификациями. Свиньи, полученные биотехнологической компанией Revivicor (США) несут модификации в 10 генах. Компания использует породу свиней стандартного размера, что сопряжено с риском разрастания органа в слишком крупный для человеческого организма. Компания eGenesis (США) получила генномодифицированных минипигов — миниатюрные свиньи были выбраны из-за большего сходства по размеру органов. Они несут 69 модификаций — помимо нокаута углеводных антигенов и контроля иммунного ответа из их генома также удалены ретровирусы свиней. Наконец, минипиги, получаемые в Аньхойском медицинском университете (Китай), несут 10 модификаций, но их список отличается от того, который использует Revivicor. Важно понимать, что во всех случаях эти животные с отредактированным геномом не представляют собой стабильные линии. Человеческие гены у них представлены в гемизиготном состоянии. На сегодняшний день несколько пациентов получили такие ксенотрансплантаты. Из шести случаев пересадки почки четыре идут успешно, рекордная продолжительность функционирования трансплантата в организме — 271 день (свинья-донор была предоставлена компанией eGenesis), реципиент в настоящее время жив и находится на гемодиализе в ожидании человеческого донорского органа. Все это пока отдельные случаи экспериментального лечения. Но в этом году в США получили одобрение клинические испытания фазы 1 для ксенотрансплантации почки. В них планируют набрать 6 участников, а в случае успеха расширить когорту до 50. Одобренный протокол КИ предполагает, что почку генномодифицированной свиньи будут подключать к организму пациента путем перфузии из соображений безопасности. Уже сейчас ксенотрансплантация — перспективное направление медицины. Ее развитию может способствовать разработка более обширной схемы модификаций, что позволит дополнительно снизить иммунный ответ и риск отторжения органа. Кроме того, процесс получения свиней-доноров можно ускорить за счет создания стабильных линий и совершенствования методов редактирования генома. Еще одна перспектива — это создание химерных органов, содержащих клетки как свиньи, так и человека. Все это, конечно, потребует регуляторного одобрения со стороны государства. Заключительный доклад прозвучал под лаконичным заголовком «Новое в трансфузиологии». Его прочитал председатель секции Евгений Жибурт, академик РАЕН, д.м.н., профессор ФГБУ «НМХЦ им. Н.И. Пирогова». Согласно официальной статистике Минздрава по переливанию крови в России в 2016–2024 гг, за последний год на 0,5% сократилось число переливаний, суммарный объем переливаемой крови и ее компонентов возрос на 2,5%, число реципиентов практически не изменилось. Динамика российских показателей за более долгий период — с 1999 по 2020 — говорит о том, что количество доноров и донаций крови сократилось. Число доноров в 2020 году составило около 55% от их числа в 1999, а донаций — 69% от того, что было 21 год назад. Выданных доз тромбоцитов, наоборот, почти в 9 раз больше (893%). На уровне госрегулирования все эти процедуры регламентированы постановлением правительства РФ от 14.05.2025 №641 «Об утверждении Правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов». В число задач современной трансфузиологии в России входит развитие отечественного производства препаратов плазмы крови, чтобы покрыть существующую потребность в ней. Одно из направлений — привлечение доноров иммуноспецифической плазмы с анти-D антителами. Это еще раз подчеркивает важность создания регистра редких доноров. Также намечена разработка протокола массивной трансфузии, и Российская ассоциация трансфузиологов приглашает к совместному исследованию в этой области. Дилемма трансфузиологии заключается в том, что терапевтическая потребность — переливание крови или ее компонентов — сопряжена с рисками для пациента. Какая тактика переливания эритроцитов лучше для пациента — ограничительная или либеральная? Результаты большинства исследований демонстрируют, что при ограничительном подходе к переливанию клинические исходы благоприятнее. Однако это не всегда так — при острых повреждениях головного мозга или сердца, например, либеральная тактика показывала себя лучше. Из этой дилеммы и клинического опыта выводятся правила назначения эритроцитов. Антигены групп крови, которые необходимо учитывать при переливании, у человека кодируются 53-мя генами. Всего насчитывается 367 антигенов в 48 системах групп крови. Ключевая — ABO — была открыта в 1900 году, когда Карл Ландштейнер проанализировал, как взаимодействует кровь шестерых его коллег при попарном смешивании. В 1930 году ему присудили Нобелевскую премию. С совместимостью групп крови связаны не только риски при трансфузиях, но и гемолитическая болезнь плода и новорожденного, которая может развиться при резус-конфликте беременной женщины и ее плода. Производством человеческого анти-D иммуноглобулина, который позволяет предотвратить развитие патологии, занимаются в ОБУЗ «ИОСПК». Для изготовления препарата используют донорскую антирезусную плазму. text text text text text text text Информация о докладчиках Логинова Мария Александровна, д.б.н., ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России, г. Киров Киселева Елена Владимировна, ГБУЗ Самарская областная клиническая станция переливания крови, г. Самара Чумак Анна Александровна, к.м.н., ГБУЗ «Центр крови имени О. К. Гаврилова ДЗМ», г. Москва Пшеничникова Олеся Сергеевна, к.б.н., ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, г. Москва Зубкова Александра Евгеньевна, ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), г. Москва Жибурт Евгений Борисович, академик РАЕН, д.м.н., профессор, ФГБУ «НМХЦ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, г. Москва Source: https://pcr.news/novosti/md-2025-molekulyarnye-metody-v-transfuziologii-i-transplantologii/