Как появились первые животные? Одна древняя колония клеток "забыла" разделиться Пост опубликован в блогах iXBT.com, его автор не имеет отношения к редакции iXBT.com (подробнее ») Если автор пообещал вам публикацию на iXBT.com (а не в блогах iXBT.com), то сообщите об этом, пожалуйста, на почту abuse@corp.ixbt.com 5 часов назад Каждый сложный организм, включая человека, когда-то был одной-единственной клеткой. Переход от одноклеточной жизни к многоклеточной — один из самых фундаментальных скачков в истории эволюции. Но как он произошел? Какие генетические инструменты позволили клеткам не расходиться после деления, а кооперироваться и строить единую структуру? Ответы на эти вопросы скрыты в геномах наших ближайших одноклеточных родственников — хоанофлагеллят. Эти микроскопические организмы живут в воде и при определенных условиях способны формировать простые многоклеточные колонии, напоминающие шарики. Одна из таких, Salpingoeca rosetta, стала ключевым объектом для ученых, пытающихся реконструировать первые шаги к животной жизни. Колонии Salpingoeca rosetta Автор: By Mark J. Dayel Источник: commons.wikimedia.org Чтобы понять, как гены управляют этим процессом, их нужно «выключать» и смотреть, что изменится. Но до недавнего времени генетические манипуляции с S. rosetta были крайне сложной задачей. Новое исследование предлагает техническое решение этой проблемы, и попутно делает открытие о древних функциях генов, которые сегодня управляют ростом наших органов. Зачем нам генетический «скальпель»? Самый надежный способ понять, как работает сложный механизм — убрать одну деталь и посмотреть, что сломается. В генетике этот подход называется «нокаутом гена». Ученые целенаправленно повреждают один ген, чтобы выяснить его функцию. В случае с S. rosetta этот процесс был неэффективным. Существующие методы давали успешный результат в лучшем случае в 10-15% попыток, а иногда и вовсе не работали. Исследователям приходилось вручную проверять сотни, а то и тысячи клеточных клонов, чтобы найти один-единственный с нужной мутацией. Это отнимало месяцы и тормозило процессы исследования. Нужен был более надежный инструмент. Место хоанофлагеллят на древе жизни, их многоклеточное развитие и принцип генетического «выключения» гена rosetteless. (A) Филогенетическое древо опистоконтов (животные, грибы и их родственники). Оно показывает, что хоанофлагелляты — ближайшие одноклеточные родственники животных (их сестринская группа). (B) Строение клетки хоанофлагелляты и формирование из нее многоклеточной колонии-rosette у вида Salpingoeca rosetta. Клетки делятся, но не расходятся. Этот процесс запускается веществами, которые выделяет бактерия Algoriphagus machipongonensis. В основе колонии — внеклеточный матрикс («клей»), для создания которого необходимы белки Rosetteless, Jumble и Couscous. (C) Схема генетической кассеты, которую ученые встраивают в ДНК с помощью CRISPR-Cas9. Она состоит из участков для точного наведения на цель (homology arms), стоп-сигналов для выключения гена и гена устойчивости к антибиотику (puromycin resistance). (D) Схема гена rosetteless (rtls). Показано, в какое место гена нацелена направляющая РНК (gRNA), чтобы встроить кассету и выключить его функцию. (E) Схема эксперимента по «выключению» гена (нокауту). В клетки доставляют комплекс Cas9:gRNA и ремонтную кассету. Затем проводят отбор с помощью антибиотика (puromycin), в результате чего выживают только клетки с успешно измененным геном. Из них выращивают отдельные клеточные линии (клоны). Автор: Combredet, Chantal et al. Cell Reports Источник: www.cell.com Новый метод: метка и отбор Исследователи разработали подход, основанный на технологии CRISPR-Cas9 — молекулярных ножницах, которые могут разрезать ДНК в строго определенном месте. Но главная идея заключалась в том, что именно вставить в место разреза. Они создали специальную генетическую кассету, которая решает две задачи одновременно. Она содержит стоп-сигналы, которые гарантированно прерывают работу целевого гена. Она несет в себе ген устойчивости к антибиотику. После генетической модификации в культуру клеток просто добавляют антибиотик. Все организмы, в которых эксперимент прошел неудачно, погибают. Выживают только те, в чью ДНК успешно встроилась кассета, — то есть именно те клетки, которые и были нужны ученым. Эффективность нокаута выросла с нескольких процентов до 40-100%. Теперь получение нужных мутантов стало быстрым и предсказуемым процессом. Визуальное и генетическое подтверждение успешного «выключения» гена rosetteless у клонов rtls^pacl1. (A) Как выглядит организм со сломанным геном rosetteless. В обычных условиях клетки S. rosetta образуют простые цепочки. После добавления стимулирующей бактерии (Algoriphagus) нормальные клетки формируют сферические колонии-rosette, а мутанты с неработающим геном rosetteless так и остаются цепочками. (B-H) Внешний вид клеток, полученных в ходе эксперимента. Все без исключения клоны (KO), созданные с помощью нового метода, показали ожидаемый «сломанный» фенотип — они не смогли сформировать rosette. Контрольные группы (клетки дикого типа и клетки, обработанные неполным набором для редактирования) выглядели как нормальные. (I) Генетическая проверка методом PCR. Этот анализ подтвердил, что во всех девяти проверенных клонах-мутантах в ген rosetteless встроена кассета. PCR-продукт нормального гена имеет длину 728 bp, в то время как у модифицированного гена (rtls^pacl1) его длина, как и ожидалось, значительно больше — 2,672 bp. (J) Окончательное подтверждение с помощью секвенирования (прочтения ДНК). Прочтение генетического кода в месте вставки подтвердило, что кассета встроилась в ген rtls именно так, как было запланировано. «Ref» показывает ожидаемую последовательность, а «Sequence» — фактическую последовательность, полученную в ходе эксперимента. Автор: Combredet, Chantal et al. Cell Reports Источник: www.cell.com Что контролирует размер колонии? Вооружившись новым методом, команда взялась за сигнальный путь Hippo. У животных, от мух до человека, этот комплекс генов выполняет функцию контроллера роста органов. Он следит, чтобы печень или сердце не росли бесконтрольно, регулируя скорость деления клеток. Но что этот путь делал у одноклеточных предков, у которых не было ни органов, ни тканей? Ученые выключили у S. rosetta один из ключевых генов этого пути — Warts. В итоге, клеточные колонии, которые они формировали, стали гигантскими. В среднем они содержали вдвое больше клеток, чем обычные колонии, а некоторые разрастались до 60 клеток вместо стандартных 10-15. Возможно, клетки просто начали делиться быстрее? Проверка показала, что нет. Скорость их размножения даже немного снизилась. Тогда в чем же дело? Дело не в скорости, а в клее Причина гигантизма оказалась в другом. Исследователи обнаружили, что клетки с отключенным геном Warts начали производить гораздо больше компонентов внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс — это сложная сеть из белков и сахаров, которую клетки выделяют наружу. По сути, это клей и структурный каркас, который скрепляет колонию и придает ей форму. В норме, когда колония S. rosetta достигает определенного размера, она делится на две. Но у мутантов клея было так много, что структура становилась прочнее и стабильнее. Это позволяло колонии расти дальше, не распадаясь. Таким образом, сигнальный путь Hippo у предков животных контролировал размер многоклеточной структуры, но делал это совершенно иначе, чем у нас. Он управлял не количеством клеток, а количеством межклеточного соединителя. «Выключение» генов warts и yorkie путем полного удаления их участков и замены на кассету с геном устойчивости. (A) Принцип удаления гена warts: ДНК разрезается одновременно в двух местах (в начале и в конце гена) с помощью двух направляющих РНК. Весь участок между разрезами удаляется, а на его место встраивается кассета. (B) Схема направляющих РНК, которые использовались для удаления генов hippo и yorkie. Попытка оказалась успешной для гена yorkie, но не для hippo. (C и D) Графики роста. Клетки с удаленными генами (warts^pacΔ1 и yorkie^pacΔ1) размножаются медленнее, чем клетки дикого типа. Закрашенная область на графике (C) показывает стандартное отклонение, а столбцы на графике (D) — средние значения. (E) Rosettes у мутантов warts^pacΔ1 оказались значительно крупнее, чем у обычных клеток (статистическая значимость p = 0.7%). (F-H) Внешний вид колоний после стимуляции бактерией Algoriphagus. Все типы клеток формируют rosettes, однако rosettes мутанта warts^pacΔ1 заметно крупнее, чем у дикого типа и мутанта yorkie^pacΔ1. Автор: Combredet, Chantal et al. Cell Reports Источник: www.cell.com Древний фундамент для новой архитектуры Это проливает свет на логику эволюции. Похоже, что генетическая программа, изначально отвечавшая за производство структурных материалов, в ходе эволюции животных была перепрофилирована. Она сохранила свою главную функцию — контроль над размером, — но сменила инструмент. Вместо управления клеем она начала управлять скоростью клеточного деления. Исследование показывает, как сложные биологические системы строятся на основе уже существующих, более древних механизмов. Изучая геномы наших дальних одноклеточных родственников, мы находим чертежи, по которым природа вела свое строительство. Каждый такой ген помогает нам понять, как однажды возникло всё разнообразие животной жизни. Изображение в превью: Source: https://www.ixbt.com/live/science/kak-poyavilis-pervye-zhivotnye-odna-drevnyaya-koloniya-kletok-zabyla-razdelitsya.amp.html